Реакция агглютинации (от лат. agglutinatio - склеивание) - склеивание корпускул (бактерий, эритроцитов и др.) антителами в присутствии электролитов.
Реакция агглютинации проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из корпускул (например, бактерий), «склеенных» антителами (рис. 7.37). Реакцию агглютинации используют для: определения возбудителя , выделенного от больного; определения антител в сыворотке крови больного; определения групп крови.
Рис. 7.37 а,б . Реакция агглютинации с IgM -антителами (а) и IgG -антителами (б )
1. Определение возбудителя, выделенного от больного Ориентировочная реакция агглютинации на стекле (рис. 7.38). К капле агглютинирующей сыворотки (разведение 1:20) добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного. Образуется хлопьевидный осадок.
Рис. 7.38.
Развернутая реакция агглютинации с возбудителем, выделенным от больного (рис. 7.39). К разведениям агглютинирующей сыворотки добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного.
Рис. 52
2. Определение антител в сыворотке крови больного
Развернутая реакция агглютинации с сывороткой крови больного (рис. 7.39). К разведениям сыворотки больного добавляют диагностикум.
- Агглютинация с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие 0-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации.
- Агглютинация с Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие жгутиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.
3. Реакция агглютинации для определения групп крови
Реакцию агглютинации для определения групп крови применяют для установления системы АВО (табл. б) с помощью агглютинации эритроцитов антителами иммунной сыворотки против антигенов групп крови А (И), В (III). Контролем служат: сыворотка, не содержащая антител, т.е. сыворотка АВ (IV) группы крови; антигены, содержащиеся в эритроцитах групп А (II), В (III). Отрицательный контроль не содержит антигенов, т. е. используют эритроциты группы О (I).
Таблица 7.6. Определение групп крови АВО
| Результаты реакции |
Групповая |
|
|
принадлежность |
||
|
исследуемой |
||
|
эритроцитов со |
сыворотки (плазмы) |
|
|
стандартными |
со стандартными |
|
|
сыворотками | ||
Развернутая реакция агглютинации (РА ). Для определения AT в сыворотке крови больного ставят развёрнутую реакцию агглютинации (РА) . Для этого к серии разведений сыворотки крови добавляют диагностикум - взвесь убитых микроорганизмов или частицы с сорбированными Аг. Максимальное разведение, дающее агглютинацию Аг, называют титром сыворотки крови.
Разновидности реакции агглютинации (РА ) для выявления AT - кровяно-капельная проба на туляремию (с нанесением диагностикума на каплю крови и появлением видимых белёсых агглютинатов) и реакция Хаддльсона на бруцеллёз (с нанесением на каплю сыворотки крови диагностикума, окрашенного генциановым фиолетовым).
Ориентировочная реакция агглютинации (РА)
Для идентификации выделенных микроорганизмов ставят ориентировочную РА на предметных стёклах. Для этого к капле стандартной диагностической антисыворотки (в разведении 1:10, 1:20) добавляют культуру возбудителя. При положительном результате ставят развёрнутую реакцию с увеличивающимися разведениями антисыворотки.
Реакцию считают положительной, если агглютинацию наблюдают в разведениях, близких к титру диагностической сыворотки.
О-Аг . Соматические О-Аг термостабильны и выдерживают кипячение в течение 2 ч. При взаимодействии с AT образуют мелкозернистые агрегаты.
Н-Аг . Н-Аг (жгутиковые) термолабильны и быстро разрушаются при 100 °С, а также под действием этанола. В реакциях с Н-антисывороткой через 2 ч инкубации образуют рыхлые крупные хлопья (образованы бактериями, склеившимися жгутиками).
Vi-Ar брюшнотифозных бактерий относительно термостабилен (выдерживает температуру 60-62 °С в течение 2 ч); при инкубации с Vi-антисывороткой образуется мелкозернистый агглютинат.
Реакции прямой гемагглютинации
Простейшая из подобных реакций - агглютинация эритроцитов, или гемагглютинация, применяемая для определения групп крови в системе AB0. Для определения агглютинации (или её отсутствия) используют стандартные антисыворотки с анти-А и анти-В-агглютининами. Реакция называется прямой, так как исследуемые Аг - естественные компоненты эритроцитов.
Общие с прямой гемагглютинацией механизмы имеет вирусная гемагглютинация. Многие вирусы способны спонтанно агглютинировать эритроциты птиц и млекопитающих, их добавление к суспензии эритроцитов вызывает образование агрегатов из них.
Агглютинации реакция Агглютинации реакция
(РА) - способ выявления и количественного определения Аг и Ат, основанный на их способности к образованию видимых невооруженным глазом агломератов. В д-ке инфекц. болезней или в др. целях применяется для идентификации неизвестных микробов и клеток, для определения присутствия и количества Ат в с-ке крови и др. жидкостях. Принцип определения основан на специфичности взаимодействия Аг и Ат и состоит в нахождении известного по неизвестному. Существует много вариантов РА: количественные и качественные, пробирочные и на стекле, объемные и капельные, обычные, ускоренные и экспресс-методы. Для постановки РА необходимы: 1) с-ка крови. В варианте с определением вида (вара) бактерий используют производственные агглютинирующие с-ки, изготовляемые путем иммунизации кроликов. В варианте с определением вида Ат берут с-ку крови, получаемую от иссл. людей или животных. С-ка должна быть стерильной и не содержать взвешенных частиц. Готовят основное разведение на физ-растворе. Оно должно быть в 2 -4 раза ниже диагностического титра при данном заболевании; 2) Аг . В варианте реакции с определением типа Ат используют производственные диагностикумы; в варианте с определением Аг диагностикумы готовят сами в виде 1 -3-миллиардной взвеси на физрастворе 18-20-часовой агаровой (реже бульонной) к-ры иссл. микроба, инактивированной прогреванием на водяной бане при 70°С в течение 1 ч или 24-часовой инкубацией при 37°С с формалином (конечная концентрация 0,2%); 3) электролит в виде физраствора. Техника постановки объемной серийной пробирочной РА для определения титра Ат в с-ке: из основного разведения с-ки готовят несколько рядов рабочих разведении. Число рядов зависит от количества взятых в опыт диагностикумов, число и факторы разведения определяются диагностическим титром предполагаемого заболевания. В ряду по меньшей мере должны быть разведение, соответствующее диагностическому титру Ат, два разведения ниже и два разведения выше его. напр., если диагностический титр равен 1:100, то при объемном способе постановки РА должны быть приготовлены следующие разведения с-ки: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1"400; при капельном методе первое разведение (1:25) не нужно, зато необходимо еще одно более высокое разведение - 1:800. В научных исследованиях с-ку титруют до отрицательной реакции. Разводят ее следующим образом: во все опытные пробирки, кроме 1-й, наливают по 0,25 мл физраствора при постановке реакции в объеме 0,5 мл и по 0,5 мл при постановке реакции в объеме 1 мл. В 1-ю и 2-ю пробирки вливают по 0,25 (0,5) мл основного разведения с-ки, из 2-й пробирки, в к-рой объем и разведение с-ки увеличились в 2 раза, 0,25 (0,5) мл переносят в 3-ю, из 3-й в 4-ю и т.д. до последней, из к-рой 0,25 (0,5) мл для уравновешивания объемов выливают во все. Каждое разведение с-ки осуществляют с помощью отдельной пипетки. Если в опыт берут несколько диагностикумов, то для каждого из них готовят таким же способом свой ряд разведении. В каждое разведение с-ки доливают диагностикум в объеме, равном объему с-ки, в результате чего разведение в каждой пробирке увеличивается в 2 раза. Опыту соответствуют контроль с-ки (0,25 -0,5 мл основного разведения с-ки и столько же физраствора) и контроль Аг (0,25 - 0,5 мл диагностикума и столько же физраствора). Если в опыт берут несколько диагностикумов, то каждому соответствует свой контроль Аг. Штатив с пробирками хорошо встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 4 ч, а затем оставляют при комнатной температуре до следующего дня, после чего проводят учет РА, основываясь на количестве осадка и степени просветления жидкости. Определение этих показателей в зависимости от характера агглютинатов осуществляют невооруженным глазом на темном фоне, в агглютиноскопе или над вогнутой поверхностью зеркала от микроскопа. Учет начинают с контролей: контроль с-ки должен быть прозрачным, Аг - равномерно мутным (после встряхивания пробирки). Если контроли хорошие, устанавливают наличие и степень агглютинации во всех опытных пробирках, к-рую обозначают плюсами: большой осадок и полное просветление жидкости - 4 плюса; большой осадок и неполное просветление жидкости -3 плюса; заметный осадок и заметное просветление жидкости- 2 плюса. После этого определяют титр: наибольшее разведение с агглютинацией интенсивностью не менее 2 плюсов. Титр иссл. с-ки сравнивают с диагностическим титром для этого заболевания. Если титр иссл. с-ки в 2 раза ниже диагностического, реакцию оценивают как сомнительную; если титр равен диагностическому -как слабоположительную; если в 2-4 раза выше его- как положительную, если в 8 и более раз выше - как резко положительную. При широком распространении Ат у здоровых людей для оценки РА применяют нарастание титра Ат. Для определения вида Аг в серийной РА число рядов должно соответствовать числу взятых для идентификации диагностических с-к. Из основного разведения диагностической с-ки готовят ряд последовательных двукратных разведении таким же способом, как и в РА для определения титра Ат. Факторы разведении зависят от титра агглютинирующей с-ки В опыте необходимо присутствие разведения, равного титру с-ки, а также в 2, 4, 6, 8 раз ниже его напр., если титр диагностической с-ки равен 1 3200, то следует использовать разведения 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 К разведениям с-ки доливают такой же объем иссл Аг, в результате разведение с-к увеличивается в 2 раза К опыту ставят 2 контроля с-ки и Аг Если в опыте участвует несколько с-к, то к каждой из них нужен свой контроль По завершении реакции штатив энергично встряхивают и помещают в термостат при 37°С Результаты учитывают, как описано выше Оценка реакции имеет особенности Для того чтобы сделать вывод о соответствии иссл. Аг взятой в опыт с-ке, титр реакции должен соответствовать не менее половине титра стандартной диагностической с-ки Титры в 1 4 и ниже рассматривают как групповую реакцию Капельный м д постановки РА отличается от объемного тем, что с-ку разводят в объеме 1 мл, Аг применяют в более высокой концентрации (10 млрд/мл) и добавляют его по 1 - 2 капли в пробирку Разведение с-ки после внесения Аг считают неизмененным В остальном методика постановки, учета и оценки аналогична объемному методу
(Источник: «Словарь терминов микробиологии»)
ИММУНОМИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Иммунологические методы применяют для решения многих задач:
1. Оценка состояния иммунной системы человека (иммунного статуса) по определению количественных и функциональных характеристик клеток иммунной системы и их продуктов.
2. Определение состава и характеристик тканей человека: групп крови, резус фактора, трансплантационных антигенов.
3. Диагностика инфекционных болезней и резистентности к ним по обнаружению и установлению титров антител (серодиагностика), выявлению антигенов возбудителей в организме, определению клеточных реакций на эти антигены.
4. Сероидентификация культур бактерий и вирусов, выделенных из организма человека и животных.
5. Выявление в организме человека и во внешней среде любых веществ, обладающих антигенными или гаптенными свойствами (гормоны, ферменты, яды, лекарства, наркотики и т.п.).
6. Выявление иммунопатологических состояний, аллергий, трансплантационных и противоопухолевых реакций.
Процесс взаимодействия антигена и антитела в серологических реакциях протекает в две фазы:
1) специфическая - фаза взаимодействия, в которой происходит комплементарное соединение активных центров антител (паратопов) и эпитопов антигена. Обычно эта фаза длится несколько секунд или минут;
2) неспецифическая - фаза проявления, характеризуется внешними признаками образования иммунных комплексов. Эта фаза может развиваться от нескольких минут до нескольких часов.
Оптимальное специфическое взаимодействие антител с антигеном происходит в изотоническом растворе с рН, близким к нейтральному. Реакция антиген-антитело в системе in vitro может сопровождаться возникновением нескольких феноменов
· агглютинации,
· преципитации,
· лизиса.
Внешние проявления реакции зависят от физико-химических свойств антигена (размер частиц, физическое состояние), класса и вида антител (полные и неполные), а также условий опыта (консистенция среды, концентрация солей, рН, температура).
Поливалентность антигенов и антител обеспечивает возникновение видимых невооруженным глазом агрегатов. Это происходит в соответствии с теорией образования сетей, согласно которой к образовавшемуся комплексу антиген-антитело последовательно присоединяются другие молекулы антител и антигена. В результате формируются сетевые структуры, которые превращаются в агрегаты, выпадающие в осадок. Характер и выраженность реакции зависят от количественного соотношения антигенов и антител. Наиболее интенсивно реакции проявляются в том случае, если реагенты находятся в эквивалентном соотношении.
Необходимое условие образование решетки (сетей) - наличие более трех антигенных детерминант на каждую молекулу антигена и по два активных центра на каждую молекулу антитела. Молекулы антигена являются узлами решетки, а молекулы антител - связующими звеньями. Область оптимальных соотношений (зона эквивалентности) концентраций антигена и антител, когда в надосадочной жидкости после образования осадка не обнаруживаются ни свободные антигены, ни свободные антитела.
Агрегаты, способные выпадать в осадок, образуются при соединении антигенов с полными антителами. Неполные антитела (моновалентные) не вызывают образования сетевых структур и крупных агрегатов. Для выявления таких антител используют специальные методы, основанные на использовании антиглобулинов (реакцию Кумбса).
Серологические реакции, благодаря высокой специфичности и чувствительности, применяют для выявления и количественного определения антигенов и антител. Количество иммунореагентов в реакциях выражают титром - максимальным разведением сыворотки или антигена, при котором еще наблюдается реакция.
Серологические реакции в микробиологических и иммунологических лабораториях используют в двух целях:
1) для сероидентификации микроорганизмов, токсинов, антигена вообще с помощью известного антитела (иммунной диагностической сыворотки),
2) для серодиагностики - определения природы антитела в сыворотке крови больного при бактериальных, вирусных, реже других инфекционных заболеваниях с помощью известного антигена (диагностикума).
Для определения родовой, видовой и типовой принадлежности антигена необходимы заведомо известные иммунные диагностические сыворотки. Их получают путем многократного введения животным (чаще кроликам) в нарастающих дозах убитых или живых микроорганизмов, продуктов их распада, обезвреженных или нативных токсинов. После определенного цикла иммунизации животных делают массивное кровопускание или тотальное обескровливание животного. Кровь, собранную в стерильную посуду, сначала помещают в термостат при температуре 37°С на 4 - 6 ч для ускорения свертывания, затем - в ледник на сутки. Полученную прозрачную сыворотку отсасывают в стерильную посуду, добавляют консерванты, определяют титр антител, проверяют на стерильность и разливают в ампулы.
Используются неадсорбированные и адсорбированные диагностические сыворотки. Неадсорбированные сыворотки обладают высокими титрами антител, но способны давать групповые (перекрестные) реакции.
Адсорбированныесыворотки отличаются строгой специфичностью действия (реагируют только с гомологичным антигеном). Сыворотки, содержащие антитела только к одному определенному антигену называются монорецепторными.
Выпускают также сыворотки, меченные флюорохромами, ферментами, радиоизотопами, которые позволяют с высокой степенью точности обнаружить даже следы антигена.
В качестве антигенов (диагностикумы) в серологических реакциях применяют взвеси живых или убитых бактерий, продуктов их расщепления, токсины, вирусы. В ряде случаев используют экстракты или выделенные химическим путем антигены из микроорганизмов и тканей животных.
Все иммуномикробиологические методы можно разделить на 3 группы :
1) основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (феномены агглютинации, преципитации, гемагглютинации, иммобилизации и др.);
2) основанные на опосредованном взаимодействии антигена с антителом (реакции непрямой гемагглютинации, коагглютинации, латекс-агглютинации, угольной аггломерации, бентонит-агглютинации, связывания комплемента и др.);
3) с использованием меченых антител или антигенов (метод флюоресцирующих антител, иммуноферментный и радиоиммунный анализы и другие методы).
РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ
В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.
Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген);
2) антитело (агглютинин)
3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).
Ориентировочная реакция агглютинации (РА)
Ориентировочная, или пластинчатая, РА ставится на предметном стекле при комнатной температуре. Для этого пастеровской пипеткой на стекло наносят раздельно каплю сыворотки в разведении 1:10 - 1:20 и контрольную каплю изотонического раствора натрия хлорида. В ту и другую бактериологической петлей вносят колонии или суточную культуру бактерий (каплю диагностикума) и тщательно перемешивают их. Реакции учитывают через несколько минут визуально, иногда с помощью лупы (х5). При положительной РА в капле с сывороткой отмечают появление крупных и мелких хлопьев, при отрицательной - сыворотка остается равномерно мутной.
Развернутая реакция агглютинации с целью выявления титра специфических антител у больного.
Развернутая РА для серодиагностики ставится в сыворотке больных. Ее разводят и изотоническом растворе натрия хлорида от 1:50 - 1:100 до 1:800 или 1: 1600. Так как в более низких титрах сыворотки могут находиться нормальные агглютинины, имеющиеся у здоровых людей или больных с другим диагнозом (диагностический титр). В качестве антигена в этой реакции используют диагностикумы - заведомо известные взвеси, как правило, убитых бактерий.
В агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:100, и, смешав ее, 1 мл переносят во вторую, из второй - в третью и т.д. В полученные двухкратные разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более) вносят по 1-2 капли взвеси бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2 часа, затем сутки выдерживают при комнатной температуре.
Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании. В контрольных пробирках агглютинации не должно быть. Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками: ++++ - полная агглютинация (хлопья агглютината в абсолютной прозрачной жидкости); +++ - неполная агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости); ++ - частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жидкость слегка мутная); + - слабая, сомнительная агглютинация - жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы; - - отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная).
За титр сыворотки принимают последнее ее разведение, в котором интенсивность агглютинации оценивается не менее чем два плюса (++)
Лекция № 16
Словарик
НЕПОСРЕДСТВЕННЫЙ – прямо следующий без чего-нибудь, без последующих звеньев.
ОПОСРЕДОВАННО – через другие клетки, не прямо.
СНИЖАТЬ ≠ УВЕЛИЧИВАТЬ (активность клеток).
ОТТОРГНУТЬ – не принять, отвергнуть. Организм отторг трансплантированный орган.
Реакции иммунитета.
Реакции иммунитета – это реакции специфического взаимодействия (связывания) антигена и антитела или антигена и сенсибилизированного Т-лимфоцита.
Эти реакции протекают in vitro (в пробирке) и in vivo (в живом организме).
В этих реакциях участвует сыворотка (serum), поэтому они называются серологическими .
Реакции иммунитета используются для диагностики инфекционных заболеваний. При этом неизвестный компонент определяется по известному компоненту, что основано на специфичности взаимодействия антигена с антителом. Если известно антитело , то можно выявить (обнаружить) неизвестный антиген . Если же известен антиген , то по нему можно обнаружить неизвестные антитела .
Таким образом, реакции иммунитета используются:
1) для серологической диагностики (серодиагностики) заболеваний - обнаружение в сыворотке крови больных людей антител к определенному возбудителю инфекционного заболевания (известному антигену); если в сыворотке крови больного человека присутствуют антитела к какому-либо возбудителю, то именно этот возбудитель и вызвал данное инфекционное заболевание;
2) для серологической идентификации (сероидентификации) микробов - для установления вида возбудителя заболевания при помощи иммунных диагностических сывороток (известных антител); если антитела связывают возбудителя, выделенного от больного человека, то этот микроб идентичен тому, которым иммунизировали животного при получении иммунной диагностической сыворотки.
Реакции иммунитета протекают в 2 фазы:
1) специфическая фаза – соединение активного центра антитела с детерминантной группой антигена с образованием комплексов антиген-антитело; эта фаза протекает быстро, но нет видимого эффекта;
2) неспецифическая фаза – появление видимого эффекта взаимодействия антигена и антитела – выпадение осадка (агглютинация) или помутнение (преципитация), что позволяет увидеть образование комплексов антиген-антитело и сделать вывод о соответствии антигена и антитела друг другу.
К реакциям иммунитета относятся реакция агглютинации (РА), реакция преципитации (РП), реакция связывания комплемента (РСК).
Реакция агглютинации – это склеивание и выпадение в осадок микробных или других клеток (эритроцитов) под действием антител в присутствии электролита. Видимый эффект реакции (феномен агглютинации) – образование осадка, который называется агглютинатом.
Эту реакцию используют для серодиагностики и сероидентификации . РА используют для серодиагностики (обнаружение антител в сыворотке крови больных) брюшного тифа и паратифа (реакция Видаля), бруцеллеза (реакция Райта), туляремии и лептоспироза . РА используют для сероидентификации (определения вида возбудителя, выделенного от больного) при кишечных инфекциях, коклюше, холере и др.
Компоненты реакции:
1. Антиген (агглютиноген) – это целые (не разрушенные) микробные или другие клетки (корпускулярный , нерастворимый антиген ). Агглютиногены – это взвесь живых или убитых микробных клеток или других каких-либо клеток. Антигены могут быть как неизвестными, так и известными. Неизвестный агглютиноген – это микробная культура, выделенная из организма больного, которую необходимо определить. Известный антиген – диагностикум – диагностический препарат - взвесь убитых микробов известного вида в физиологическом растворе. Эта взвесь мутная (непрозрачная ), т.к. микробные клетки не растворяются, а остаются целыми. Известный агглютиноген будет использоваться для обнаружения неизвестных антител в сыворотке крови больных.
2. Антитело (агглютинин) – находится в сыворотке крови. Антитела также могут быть как неизвестными, так и известными. Неизвестные антитела, которые нужно определить, находятся в сыворотке крови больного человека . Известные антитела находятся в иммунных диагностических сыворотках , которые называются агглютинирующими сыворотками . Они используются для сероидентификации, т.е. для определения неизвестного антигена – вида микробной культуры.
3. Электролит – 0,9% раствор хлорида натрия.
Получение диагностикума.
Выращенную на скошенном агаре чистую культуру возбудителя известного вида (например, возбудителя брюшного тифа) смывают 3-4 мл изотонического раствора, помещают в стерильную пробирку, каким-либо способом убивают микробы (например, кипячением и определяют густоту (должно быть 3 млрд. микробных клеток в 1 мл). Если микробные клетки убивают высокой температурой, то получают О-диагностикум (О-антиген), если же ее обрабатывают формалином, то получают Н-диагностикум (Н-антиген).
Примеры диагностикумов : сальмонеллезный диагностикум, бруцеллезный диагностикум, туляремийный диагностикум.
Получение агглютинирующих сывороток.
Животным (чаще кроликам) 5 – 7 раз через промежутки времени парентерально вводят в возрастающих дозах микробные диагностикумы (проводят гипериммунизацию) , а затем у них отбирают сыворотку крови, в которой содержатся антитела к тем микробам, из которых приготовлен диагностикум. Если иммунизацию проводят О-диагностикумом, то получают О-агглютинирующие сыворотки (содержат О-антитела), если Н-диагностикумом – Н-агглютинирующие сыворотки.
Агглютинирующие сыворотки могут быть неадсорбированными или нативными и адсорбированными .
Неадсорбированные сыворотки содержат групповые антитела к нескольким близкородственным видам микробов.
Адсорбированные сыворотки содержат антитела к одному или нескольким антигенам одного вида микроба. Если сыворотки содержат антитела только к одному антигену, они называются монорецепторными или моновалентными, если к нескольким антигенам – групповыми адсорбированными сыворотками.
Примеры агглютинирующих сывороток: сальмонеллезная монорецепторная Н-агглютинирующая сыворотка, сальмонеллезная групповая адсорбированная О-агглютинирующая сыворотка, противохолерная О-агглютинирующая сыворотка и др .
Титр агглютинирующей сыворотки – наибольшее разведение сыворотки, при котором еще обнаруживается реакция агглютинации с антигеном (титр зависит от количества антител в крови: чем больше антител, тем выше титр сыворотки).
Способы постановки РА.
1. Ориентировочная (пластинчатая) РА – проводится на стекле. На предметное стекло наносят 2 капли сыворотки и 1 каплю изотонического раствора. В одну из капель сыворотки и в каплю изотонического раствора петлей вносят микробную культуру и перемешивают. Капля изотонического раствора с микробами – контроль антигена , капля сыворотки без микробов – контроль антитела , капля сыворотки с микробами – опыт. Если в сыворотке имеются антитела, соответствующие микробным антигенам, которые с ней смешиваются, то антитела и антигены будут специфически связываться друг с другом и через 1 – 3 мин в опытной капле появятся хлопья агглютината. Контроль антигена должен быть мутным, а контроль антитела – прозрачным. Учет результатов реакции проводится по появлению хлопьев агглютината . Если выпадают хлопья – реакция положительна, т.е. антиген соответствует антителу и по антигену можно определить антитело или наоборот. Если остается помутнение – реакция отрицательная.
2. Развернутая реакция агглютинации – проводится в пробирках. Вначале готовят 2-хкратные разведения сыворотки крови больного человека от 1:50 до 1:1600. В 6 пробирок наливают по 1 мл изотонического раствора хлорида натрия. В первую пробирку вносят 1 мл сыворотки крови больного в разведении 1:50, перемешивают и получают разведение 1:100, затем 1 мл разведения 1:100 переносят во вторую пробирку и получают разведение 1:200 и т.д. Две пробирки оставляют для контроля антигена и сыворотки. В контроль сыворотки добавляют только сыворотку в разведении 1:50, в контроль антигена – только антиген. Во все остальные пробирки добавляют 0,1 мл антигена - диагностикума (О- или Н-) и ставят все пробирки в термостат при 37°С на 18-20 часов. Учет результатов реакции проводят по характеру, количеству образовавшегося осадка (агглютината) и степени мутности. Учет проводят только при следующих результатах в контролях: контроль сыворотки – прозрачный, контроль антигена – мутный. О-антитела дают мелкозернистый осадок. Н-антитела – крупнозернистый. По последней пробирке, в которой еще видна реакция агглютинации, устанавливают диагностический титр.
При серодиагностике заболеваний важно не просто обнаружить специфические антитела к определенному возбудителю, но и выявить их количество, т.е. установить такой титр антител, к огда можно говорить о наличии заболевания, вызванного этим возбудителем. Этот титр и называется диагностическим титром. Например, для диагностики брюшного тифа нужно выявить титр антител – 1:400, но не меньше. Еще более точные результаты дает выявление нарастания антител в парных сыворотках. Сыворотку больного отбирают в начале заболевания и через 3 – 5 или более дней. Если титр антител возрастает не менее, чем в 4 раза, следовательно, можно говорить о текущем заболевании.
Если развернутая реакция агглютинации ставится для сероидентификации, то используют агглютинирующие диагностические сыворотки, разведенные до титра или до половины их титра. РА считается положительной, если агглютинация обнаруживается в разведении, близком к титру диагностической сыворотки.
